细菌中的蛋白质酪氨酸磷酸化在多种细胞功能中起着重要作用，包括与群落发育和*力有关的功能。属于聚合酶和组蛋白磷酸酶（PHP）家族的金属依赖性蛋白酪氨酸磷酸酶广泛分布于革兰氏阳性细菌中。Php1酪氨酸磷酸酶的活性因保守的组氨酸残基及保守精氨酸的突变而减弱，保守的组氨酸残基对金属离子的配位很重要，而保守的精氨酸残基则是其他细菌PHP中的关键催化残基。php1基因位于编码细菌酪氨酸（BY）激酶Ptk1的基因的下游，Ptk1是体外Php1的底物。在没有可识别的中间磷酸酯形式的情况下，Php1迅速导致Ptk1转化为低酪氨酸磷酸化状态。结果表明，牙龈卟啉单胞菌具有活性的PHP和LMW酪氨酸磷酸酶，这是革兰氏阴性菌的独特配置，可使牙龈卟啉单胞菌在多物种群落中保持磷酸化/去磷酸化稳态。此外，Php1有助于激发生物体的致病潜力。
牙周疾病是人类最常见的感染之一，并且还与全身性炎症有关。牙龈卟啉单胞菌的定殖和致病性通过基于蛋白质酪氨酸磷酸化和去磷酸化的信号转导途径来调节。在这里，我们确定并表征酪氨酸磷酸化/去磷酸化轴的一个新的组成部分：聚合酶和组蛋白磷酸酶（PHP）家族酶。这种酪氨酸磷酸酶（称为Php1）是牙龈卟啉单胞菌与其他口腔细菌共同发育所必需的，并且在缺乏Php1活性的情况下，牙龈卟啉单胞菌无法在牙周炎的小鼠模型中引起疾病。这项工作对牙龈卟啉单胞菌中的蛋白质酪氨酸磷酸化/去磷酸化网络，及其对异型群落的适应性和对定植与*力的贡献提供了重要的见解。
牙龈卟啉单胞菌虽然不是牙周微生物组的优势成员，但可以通过与辅助病原体和病原菌的相互作用来提高牙周群落的共生能力（或致病潜力）。格氏链球菌（Streptococcus.gordonii）是牙龈卟啉单胞菌的主要搭档菌属，在鼠类口腔牙周炎模型中，这两种细菌的共感染比单独感染导致的牙槽骨损失更大。两种细菌物种之间的菌落发展是通过基于链球菌代谢物（例如pABA）的共黏附和化学交流介导的。先前的研究表明，牙龈卟啉单胞菌的*力和菌落发育受牙龈卟啉单胞菌的BY激酶Ptk1控制。Ptk1是Ltp1的底物，Ltp1是一种低分子量蛋白酪氨酸磷酸酶（LMW-PTP），形成关联的激酶磷酸酶对，但它们的基因位于较远的位置，在革兰氏阴性细菌中不常见，因此表明有与激酶或磷酸酶相邻的基因编码的其他磷酸酶或激酶的可能性。ptk1位于Pg中的操纵子由三个基因组成（PGN_[PGN_RS]，ptk1和PGN_[PGN_RS]）。在生物信息学上，PGN_具有类酪蛋白醇磷酸酶样的基序，属于蛋白酪氨酸磷酸酶（PHP-PTP）的聚合酶和组蛋白磷酸酶家族。大多数PHP-PTPs在革兰氏阳性细菌中发现，例如Streptococcuspneumoniae,Bacillussubtilis,Lactobacillusrhamnosus，它们参与了荚膜多糖产生，DNA代谢，细胞分裂和细菌侵袭的控制。在这项研究中，我们证明PGN_编码一个活跃的PHP家族酪氨酸磷酸酶，在此命名为Php1，它可以作用于Ptk1并参与牙周疾病动物模型中的*力以及菌落发展的控制。
结果分析：
在P.gingivalis中，ptk1下游的一个PGN_基因编码一个包含PHP结构域（PF）的预测的28kDa蛋白。BLASTP分析表明，它与其他细菌种类的PHP-PTP蛋白具有重要的同源性，包括所有四个保守基序中不变性的组氨酸，天冬氨酸和精氨酸残基。此外，同源性建模表明与枯草芽孢杆菌的PHP-PTPYwqE具有很强的结构保守性。
FIG1：Php1磷酸酶活性的表征。
（A）将重组Php1与50mMρNPP（对硝基苯基膦酸酯，ρ-nitrophenylphosphate）在含有1mM（最终浓度）所示离子的反应混合物（pH8.0）中孵育。可以得出：重组Php1的磷酸酶活性还取决于Mn2+的存在，或者在较小程度上取决于Co2+的存在。
（B）Mn2+浓度对Php1抗ρNPP活性的影响。可以得出：通过增加高达4mM的Mn2+浓度可增强Php1活性，但在较高的Mn2+浓度下可降低Php1活性
（C）在反应混合物的不同pH值下测得的针对ρNPP的Php1活性。反应进行三次，数据以平均值±标准误差（SE）表示。**，P0.01；****，P0.。图中显示：当检查pH对Php1磷酸酶活性的影响时，在pH8.0至10.0的范围内增加pH可以增强活性，而在pH7.0时其活性并未明显高于背景水平。
FIG2：Ph1底物的特异性
（A）将重组Php1与uM磷酸氨基酸孵育：当使用磷酸氨基酸作为底物时，Php1对磷酸酪氨酸的活性最高，从磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸释放的磷酸盐明显减少。Na3VO4，NaF和EDTA显著抑制了针对磷酸酪氨酸的Php1活性。
（B）uM磷酸肽孵育：以磷酸肽为底物进行测试时，Php1仅对酪氨酸磷酸肽具有活性，丝氨酸磷酸肽的磷酸盐释放并未显著高于背景水平。Na3VO4，NaF和EDTA也显著抑制了针对酪氨酸磷酸肽的Php1活性。
（C）在pH8.0下有（●，4mM）或没有（▲）Mn2u和酪氨酸磷酸肽底物的Php1的饱和动力学。该图是对Michaelis-Menten方程进行的实验数据的非线性拟合。实验一式三份进行三次，并且代表性数据显示为平均值SE。**，P0.01；***，P0.。酪氨酸磷酸肽的Km为15.56±2.21μM，Vmax为31.07±1.11μM/min，kcat为0.±0.s-1，酶效率为33.29s-1μM-1。
FIG3：Php1对Ptk1的去磷酸化作用。
（A）将重组Ptk1与重组Php1（5g）孵育指定的时间，并通过磷酸酪氨酸抗体免疫印迹分析Ptk1的酪氨酸磷酸化。Ptk1的酪氨酸磷酸化呈时间和剂量依赖性降低
（B）重组Ptk1单独孵育指定的时间。Ptk1的去磷酸化需要磷酸酶，因为在没有Php1的情况下Ptk1的磷酸化水平是稳定的
（C）将重组Ptk1与所示浓度的Php1孵育min，并通过免疫印迹分析Ptk1的酪氨酸磷酸化。Ptk1的酪氨酸磷酸化呈时间和剂量依赖性降低
（D）Ptk1与Php1反应，如面板A所述，并通过Mn2+-Phos-tag-SDS-PAGE分析磷酸化。磷酸标记电泳显示在不存在离散中间体的情况下，Ptk1从最大磷酸化形式快速转变为最小磷酸化形式。
FIG4：Php1中保守的His，Cys和Arg残基的突变减弱了磷酸酶的活性。
（A）Php1域结构的示意图。选择Php1的PHP结构域的保守基序中的组氨酸，半胱氨酸和精氨酸残基进行定点诱变，以确定它们在Php1催化活性中的作用。
（B~D）使用ρNPP（B），磷酸酪氨酸（C）或酪氨酸磷酸肽（D）作为底物来测量重组Php1野生型（WT）及其突变蛋白的磷酸酶活性。实验一式三份进行三次，代表性数据显示为均值标准差（SD）。***，P0.。在保守的组氨酸残基中，用丙氨酸替代H27，H64和H消除了ρNPP、磷酸酪氨酸或酪氨酸磷酸肽底物的Php1磷酸酶活性，表明这些残基具有重要作用。一个HA取代的蛋白质在所有底物上保留了30％至50％的天然酶活性。除了必需的组氨酸残基外，基序III中第位的精氨酸残基也是功能所必需的，因为具有RA取代的Php1失去了所有酶活性。
（E）Ptk1的磷酸化。将重组的His-tagPtk1与Php1WT及其突变体衍生物一起孵育，并使用抗磷酸酪氨酸抗体通过免疫印迹法检测Ptk1的酪氨酸磷酸化。EDTA用作抑制Php1磷酸酶活性的对照。Php1衍生物C28S，H64和H将Ptk1磷酸化至与野生型Php1相似的水平，表明针对同源激酶的磷酸酶活性对这些残基的依赖性小于对合成底物的活性。
FIG5：Php1是牙龈卟啉单胞菌（Pg）–格氏链球菌（Sg）群落发展所必需的。
Pg（WT），Δphp1，Δphp1+pTphp1（CΔphp1）或Δphp1+pTphp1RA（CMΔphp1）（绿色）菌株的共聚焦扫描激光显微镜可视化，与S.g（红色）的底物反应24h。这些结果表明，Php1磷酸酶活性是在链球菌S.g基质上发展P.g微菌落所必需的。
FIG6（A）由牙龈卟啉单胞菌形成的单物种生物膜不受Php1丢失的影响。
FIG6（B）Ptk1也是牙龈卟啉单胞菌最大的细胞外多糖产生所必需的，我们发现Php1突变菌株产生的胞外多糖比亲本菌株少得多。
与Php1相反，P.g的Ltp1磷酸酶限制了S.g的群落发育。因此，在双物种群落的背景下，如何在牙龈卟啉单胞菌中差异利用两种磷酸酶是一个关键性问题。先前的研究发现，S.g分泌的对氨基苯甲酸（pABA）下调ltp1的表达，而不是php1的表达，因此刺激了群落的发展。此外，诸如Ltp1之类的LMW-PTP也可以充当氧化还原传感器，并且对H2O2的抑制高度敏感，而氨基苯甲酸的类似物是酪氨酸磷酸酶的竞争性抑制剂。因此，我们测试了pABA和H2O2对Ltp1和Php1活性的影响。
FIG7：H2O2和pABA均抑制Ltp1，但不抑制Php1。这表明S.g的WT分泌的化合物将通过选择性抑制Ltp1而促进Pg群落的发展。
FIG8：通过在鼠模型中测量牙槽骨损失来评估Php1对Pg*力的贡献。感染了亲本Pg的小鼠出现了牙槽骨丢失，这在假手术治疗的动物中未见到。
总结：
1、牙龈卟啉单胞菌（革兰氏阴性牙周病原体）表达具有二价金属离子依赖性酪氨酸磷酸酶活性的PHP蛋白Php1。
2、牙龈卟啉单胞菌胞外多糖的产生和与先前口腔生物膜成分格氏链球菌（Streptococcusgordonii）在营养耗尽的条件下的菌落产生及发展均需要活性Php1。相反，Php1的缺乏对牙龈卟啉单胞菌形成单种生物膜的能力没有影响。
3、在牙周疾病的动物模型中，Php1的缺失使牙龈卟啉单胞菌*力丧失。
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